Xét nghiệm ELISA có ý nghĩa vô cùng to lớn trong y học. Bên cạnh các máy xét nghiệm phổ biến như xét nghiệm huyết học, nước tiểu, miễn dịch, sinh hóa,… thì máy xét nghiệm elisa cũng đóng một vai trò quan trọng, không thể thiếu. Vậy xét nghiệm Elisa là gì và có […]
Xét nghiệm ELISA có ý nghĩa vô cùng to lớn trong y học. Bên cạnh các máy xét nghiệm phổ biến như xét nghiệm huyết học, nước tiểu, miễn dịch, sinh hóa,… thì máy xét nghiệm elisa cũng đóng một vai trò quan trọng, không thể thiếu. Vậy xét nghiệm Elisa là gì và có bao nhiêu loại? Hãy cùng An Sinh Medical tìm hiểu qua bài viết dưới đây nhé!
1. Xét nghiệm ELISA là gì?
ELISA là viết tắt của Enzyme-linked immunosorbent assay hay còn được gọi là enzyme immunoassay (EIA). Xét nghiệm ELISA là kỹ thuật sinh hóa được dùng trong miễn dịch học để có thể phát hiện sự có mặt của những kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu phục vụ chẩn đoán bệnh lý.
ELISA đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học và bệnh học thực vật, cũng như để kiểm tra chất lượng trong các ngành công nghiệp khác nhau.
Các kháng nguyên từ mẫu vật được gắn lên một bề mặt. Sau đó, một kháng thể đặc hiệu hơn được áp dụng trên bề mặt để nó có thể liên kết với kháng nguyên. Kháng thể này được liên kết với một enzyme, và trong bước cuối cùng, một cơ chất có chứa chất nền của enzyme được thêm vào. Phản ứng tiếp theo tạo ra một tín hiệu nhận biết, thường là một sự thay đổi màu sắc trong chất nền.
Thực hiện một xét nghiệm ELISA liên quan đến ít nhất một kháng thể có tính đặc hiệu với một kháng nguyên cụ thể. Mẫu thử với một hàm lượng không xác định kháng nguyên trên một chất mang rắn (thường là một giếng vi thể bằng polystyrene) được cố định hoặc theo cách không đặc hiệu (thông qua hấp thụ bề mặt) hoặc theo cách đặc hiệu (thông qua sự bắt giữ bởi kháng thể đặc hiệu khác cho cùng kháng nguyên, trong một “sandwich” ELISA).
Kỹ thuật Elisa
Sau khi kháng nguyên được cố định, sự phát hiện kháng thể được thêm vào, hình thành một phức hợp với kháng nguyên. Kháng thể phát hiện này có thể được kết nối hóa trị với một enzyme hoặc có thể được phát hiện bằng kháng thể thứ hai – kháng thể này đã kết nối với enzyme thông qua kết nối liên hợp sinh học. Giữa mỗi bước, thông thường giếng vi thể được rửa với dung dịch chất tẩy có nồng độ loãng để loại bỏ bất kỳ những protein hoặc kháng thể nào khi chúng không có liên kết đặc hiệu. Sau bước rửa cuối cùng, giếng vi thể này được phát triển bằng cách thêm vào chất nền của enzyme để tạo thành tín hiệu có thể quan sát được, điều này chỉ ra hàm lượng kháng nguyên có trong mẫu.
2. Nguyên lý kỹ thuật của Elisa
ELISA là một phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu. Nguyên lý của kỹ thuật ELISA là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên – antigen (KN) hoặc Kháng thể – antibody (KT) đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể – antibody (KT) hoặc kháng nguyên (KN) cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với enzyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang.
3. Các loại xét nghiệm Elisa
ELISA được dùng như một công cụ để chẩn đoán y học cũng như các bệnh lý học thực vật, dùng để kiểm tra, kiểm soát chất lượng trong các ngành khác nhau.
Xét nghiệm này có rất nhiều loại dùng cho những loại bệnh khác nhau như nhiễm trùng trực tiếp, nhiễm trùng gián tiếp, sandwich hay cạnh tranh nhưng chúng đều luôn tuân theo nguyên tắc chung đó là phát hiện ra kháng nguyên/kháng thể nhờ kháng thể đặc hiệu do cơ chế miễn dịch học.
3.1. ELISA trực tiếp
Đây được coi là phương pháp đơn giản nhất của ELISA, kháng nguyên sẽ được hấp thụ lên 1 tấm nhựa sau đó thêm một lượng lớn protein (thường là BSA) vào để khóa các vị trí liên quan khác. Trong khi đó, enzyme liên kết sẽ liên kết với một kháng thể ở một phản ứng khác và phức hợp này sẽ hấp phụ các kháng nguyên. Sau khi phức hợp dư thừa bị loại bỏ thì các phức hợp có gắn kháng nguyên/kháng thể – enzyme sẽ còn đọng lại trên giếng. Người ta thêm cơ chất đặc hiệu của enzyme vào để xảy ra phản ứng cơ chất và enzyme từ đó các tín hiệu sẽ phát ra và là đại diện cho số lượng kháng nguyên có trong mẫu.
Ưu điểm
- Đơn giản và nhanh chóng – chỉ cần một kháng thể duy nhất và quy trình làm việc chỉ bao gồm một vài bước.
- Ít sai số hơn – số lượng bước pipet tương đối nhỏ so với các phương pháp ELISA khác, chỉ có một kháng thể nên hầu như không có nguy cơ xảy ra phản ứng chéo kháng thể.
Nhược điểm của phương pháp
- Độ nhạy hạn chế do không có bước khuếch đại tín hiệu.
- Quá trình phát triển bộ KIT xét nghiệm tốn thời gian – mỗi mục tiêu xét nghiệm yêu cầu một kháng thể sơ cấp liên hợp enzyme cụ thể, điều này cũng có thể làm cho xét nghiệm tương đối tốn kém.
- Tính linh hoạt thấp: Sự gắn kết của enzym vào kháng thể có thể hạn chế (do sự sẵn có về không gian của các vị trí trên kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên là hạn chế).
- Nhiễu nền cao do tất cả các protein trong mẫu liên kết với bề mặt.
3.2. ELISA gián tiếp
Phương pháp này bao gồm 2 bước liên quan tới quá trình gắn kháng thể sơ cấp và thứ cấp đã được đánh dấu. Ban đầu kháng thể sơ cấp sẽ được ủ với kháng nguyên sau đó mới ủ với kháng thể thứ cấp. Nhưng điều này đôi khi có thể dẫn đến việc các tín hiệu trở nên không đặc hiệu vì có thể xảy ra những phản ứng chéo với kháng thể thứ cấp.
Ưu điểm
- Tính linh hoạt cao: cùng một kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng cho nhiều loại kháng thể sơ cấp.
- Độ nhạy cao – nhiều hơn một kháng thể được đánh dấu có thể liên kết với kháng thể chính.
- Phản ứng miễn dịch chọn lọc cao – không có nhiễu can thiệp vào các vị trí trên kháng thể chính.
- Kinh tế – yêu cầu ít loại kháng thể đánh dấu (gắn enzyme).
Nhược điểm
- Quy trình làm việc phức tạp hơn – cần có thêm một bước ủ cho kháng thể thứ cấp.
- Khả năng phản ứng chéo – tín hiệu không đặc hiệu do phản ứng chéo với kháng thể thứ cấp.
3.3 ELISA sandwich có độ nhạy cao
Elisa sandwich có độ nhạy cao là một loại ELISA ít phổ biến hơn nhưng lại đem lại hiệu quả cao trong phát hiện kháng nguyên. Hơn nữa, rất nhiều bộ kit thương mại đã được xây dựng dựa vào Elisa sandwich. Quy trình Elisa khá khó khăn và để tối ưu hóa được thì cần phải kiểm tra những kháng thể bắt cặp sai. Điều này sẽ đảm bảo kháng thể phát hiện những epitope khác trên protein đích và khiến chúng không cản trở những kháng thể đang gắn.
Ưu điểm
- Tính linh hoạt và độ nhạy cao: có thể sử dụng cả phương pháp trực tiếp (đơn lớp) và gián tiếp (hai lớp).
- Độ đặc hiệu cao – hai kháng thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên.
- Thích hợp cho các mẫu phức tạp – không yêu cầu phải tinh sạch kháng nguyên trước khi đo.
Nhược điểm
- Quy trình làm việc phức tạp – yêu cầu nhiều bước ủ hơn so với các định dạng ELISA khác.
- Quy trình phát triển KIT phức tạp – do phải kiểm tra phản ứng chéo giữa các kháng thể khác nhau.
3.4. ELISA cạnh tranh
Vấn đề chính của ELISA cạnh tranh đó là quá trình gắn mang tính cạnh tranh của kháng nguyên gốc (mẫu) và kháng nguyên thêm vào. Quy trình của phương pháp này sẽ khác hơn so với các phương pháp ELISA còn lại.
Ưu điểm:
- Tính linh hoạt cao nhất – có thể dựa trên định dạng ELISA trực tiếp, gián tiếp hoặc sandwich.
- Độ đặc hiệu cao nhất – kháng nguyên được bắt và phát hiện cụ thể.
- Khuếch đại tín hiệu mạnh – giảm thiểu ảnh hưởng của việc pha loãng mẫu và hiệu ứng nền mẫu.
Nhược điểm:
- Khá tốn thời gian – quy trình phức tạp.
- Phụ thuộc nhược điểm của định dạng phát hiện đã chọn.
